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Les brèves / La résistance Plasmidique aux quinolones chez les entérobactéries productrices de béta lactamase à spectre étendu au Maroc
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2012-04-04 
La résistance Plasmidique aux quinolones chez les entérobactéries productrices de béta lactamase à spectre étendu au Maroc

La résistance plasmidique aux quinolones, liée au gène qnr, a été rapportée dans plusieurs pays du monde. Bien que cette résistance soit acquise de façon indépendante, elle semble être liée à la production de b-Lactamase à Spectre Elargi (BLSE). Puisque aucune donnée n’est disponible dans les pays africains, l'équipe composée Bouchakour M., Perrier-Gros-Claude J.D. et Timinouni M. du Laboratoire de Bactériologie Moléculaire (Institut Pasteur, Casablanca), de Zerouali K. et El Mdaghri N. du 2Laboratoire de Microbiologie (Hôpital Universitaire Ibn Rochd, Casablanca), de Amarouch H. du Département de Biologie (Faculté des Sciences Ain Chock, Casablanca) et de Courvalin P. de l' Unité des Agents Antibactériens (Institut Pasteur, Paris) ont visé à déterminer la prévalence des gènes qnr au niveau du CHU Ibn Rochd, Casablanca, Maroc.

Le gène qnr a été recherché par PCR multiplex chez 39 (20%) souches (16 E. coli, 14 K. pneumoniae, 8 E. cloacae et 1 P. mirabilis), sélectionnés au hasard à partir d’un effectif de 188 entérobactéries productrices de BLSE, isolées entre Octobre 2006 et Mars 2007.

La prévalence globale du gène qnr a été de 36% (n=14 ; qnrA, 10.25% ; qnrB, 23.07% ; qnrS, 2.56%). Les gènes qnr ont été identifiés chez E. coli, Klebsiella pneumoniae et Entérobacter cloacae avec une fréquence respective de 18.7%, 50% et 62.5%. Les variants identifiés sont qnrA1, qnrB1-B2-B4 et qnrS1. Le gène qnr est détecté chez les souches sensibles et résistantes aux quinolones.

Cette étude a montré une forte prévalence du gène qnr parmi les souches BLSE isolées à l’hopital Ibn Rochd, Casablanca. La présence du gène qnr chez les souches sensibles aux quinolones pourrait faciliter la sélection in vivo des mutants résistants en présence d’antibiotique.

Mots clés : résistance, qnr, prévalence, BLSE

Introduction

Les fluoroquinolones sont massivement utilisées pour le traitement d’une grande variété d'infections bactériennes chez l’homme, notamment pulmonaires. Cette utilisation a conduit à une augmentation de la résistance à ces antibiotiques qui représente un réel problème de santé publique. Les deux principaux mécanismes de résistance aux quinolones (modification des topoisomerases de type 2 et efflux) sont dus à des mutations chromosomiques. Récemment, trois mécanismes de résistance plasmidique ont été décrits : protection des cibles des quinolones par les protéines QNR (1), hydrolyse des quinolones par une protéine dérivée d’une enzyme responsable de la résistance aux aminosides (AAC(6’)-1b-cr) (2) et pompe d’efflux spécifique des quinolones (3).

Sur le plan phénotypique, la résistance aux quinolones conférée par les trois derniers mécanismes reste à bas niveau. Quand deux gènes correspondants sont présents, les CMI de la ciprofloxacine peuvent atteindre 1 à 2 µg/ml (2).
Aucune donnée n’est disponible en Afrique sur la prévalence des gènes qnr chez les entérobactéries. Cette étude avait pour but de déterminer la prévalence de ces gènes chez les entérobactéries produisant une béta-lactamase à spectre élargi isolées à l’hôpital Ibn Rochd, Casablanca, Maroc.

Matériels et Méthodes

Souches
Les 39 souches étudiées (E.coli, n=16 ; K. pneumoniae, n=14 ; E. cloacae, n=8 ; P. mirabilis, n=1) ont été sélectionnées à partir d’un effectif de 188 entérobactéries résistantes aux ß-lactamines par production de ß-lactamase à spectre élargi (BLSE), isolées entre Octobre 2006 et Mars 2007 dans différents services de l’hôpital Ibn Rochd, Casablanca.

Sensibilité aux antibiotiques

La sensibilité aux antibiotiques a été déterminée par diffusion en gélose de Mueller-Hinton et la catégorisation clinique des souches a été faite selon les recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM). La production de BLSE a été déterminée suivant les recommandations du CA-SFM. Les CMI ont été déterminées par E-test selon les recommandations du fabricant (AES, AB Biodisk, Suède).

Recherche des gènes qnr
L'ADN a été extrait par choc thermique : une colonie a été dissociée dans 100 µl d'eau distillée stérile puis chauffée à 100°C pendant 5 min. Après centrifugation (5 min, 13.000 x g), le surnageant a été conservé à -20°C.
La recherche des gènes qnrA, qnrB et qnrS a été effectuée par PCR multiplex en utilisant des amorces spécifiques (Table 1) dans un volume final de 100µl. Les conditions de PCR étaient les suivantes : 0,4 µM de chaque amorce, 0,1 mM de dNTP, 1U de Taq Polymérase, 2.5 mM de MgCl2 et 1 µl d’ADN total. Le programme d'amplification était : dénaturation initiale de 5' min à 94°C suivie de 30 cycles de 94°C pendant 1 min, 60°C pendant 45s, et 72°C pendant 1 min, puis une élongation finale de 72°C pendant 7 min.
Recherche des gènes blaTEM, blaCTX-M et blaSHV
Les gènes blaTEM, blaCTX-M et blaSHV ont été recherchés chez les souches qnr positives. Les séquences d’amorces blaTEM et blaSHV ont été déterminées pour amplifier la totalité des BLSE des 2 familles correspondantes. Pour les BLSE de type blaCTX-M, les amorces ont été déterminées pour amplifier l’ensemble des CTX-M appartenant au groupe CTX-M-1. Les séquences des amorces sont indiquées dans la table 1. L’ADN a été amplifié dans un volume final de 50 µl, avec un mélange réactionnel identique à celui utilisé pour la recherche du gène qnr à l’exception des amorces qnr qui sont remplacées par les amorces spécifiques aux BLSE. Les conditions de PCR consistent en une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 5 minutes suivie de 30 cycles d’amplification comprenant chacun une étape d’hybridation à 52°C (blaTEM) et 60°C (blaCTX-M et blaSHV) pendant 1 minute, une étape d’élongation à 72 °C pendant une minute, puis une étape d’extension finale à 72 °C pendant 7 min.

Souches de contrôle positif
Les souches Escherichia coli U2A2118 (qnrA1), E. coli U2A2119 (qnrB1), E. coli U2A2120 (qnrS1), E. coli U2A1790 (ctx-M-1) et Salmonella sp. U2A 1446 (tem + shv) ont été utilisées comme contrôles positifs.

Séquençage et analyse des produits d’amplification
Après purification enzymatique, les produits d’amplification ont été séquencés en utilisant le kit BigDye Terminator Cycle Sequencing. Les séquences ont été effectuées à l’aide du séquenceur capillaire ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems). Les comparaisons avec les séquences connues ont été effectuées avec le programme BLAST du National Center for Biotechnology Information.

Résultats et Discussion

Le gène qnr a été détecté dans 36% des souches étudiées (n = 14; qnrA, 10,25%; qnrB, 23.07%; qnrS, 2.56%) avec des prévalences respectives de 18.7% chez E. coli, 50% chez Klebsiella pneumoniae et 62.5% chez Enterobacter cloacae. Le séquençage des produits de PCR a montré une considérable diversité des gènes qnr. En effet, trois variants qnrB ont été identifiés (B1, B2 et B4), un seul variant qnrA (A1) et un variant qnrS (S1). Cette étude montre une prévalence plus forte par rapport aux autres études comparables, effectuées dans différentes régions du monde (4). Le gène qnr était plus fréquent chez Enterobacter cloacae suivie de Klebsiella pneumoniae et E. coli. Des résultats similaires ont été rapportés par Robicsek et coll (4).
Le mécanisme de résistance médié par le gène qnr entraîne une élévation des CMI de l’ensemble des quinolones. Chez les 15 souches qnr positives, l’analyse des CMI a montré différents phénotypes de résistance aux quinolones.
Six souches avaient des CMI très élevées à la fois de la ciprofloxacine (CMI ≥ 4µg/ml) et de l'acide nalidixique (CMI ≥ 32µg/ml) (Table 2). Ce profil de résistance laisse supposer l’existence de mutations dans les cibles des quinolones (topoisomérases).
Six souches apparaissaient sensibles à l’acide nalidixique (CMI : 4-8 mg/l). Ces résultats contrastent avec ceux rapportés par Robicsek et coll. (2) pour lesquels les CMI vis-à-vis des souches qnr positives atteignent 16 mg/l. Par contre, le niveau de résistance à la ciprofloxacine a montré une augmentation non négligeable (CMI:0,125-4 mg/l). Le mécanisme responsable de cette augmentation n’est pas encore élucidé, mais comme déjà décrit dans la littérature (2), cette élévation pourrait être liée à l’émergence du gène aac(6’)-Ib-cr codant pour une enzyme a spectre limité à la ciprofloxacine et la norfloxacine, seules quinolones avec un noyau piperazinilique, cible de l’enzyme.
La majorité des souches qnr positives décrites jusqu’à présent sont multi-résistantes et produisent en particulier une _-lactamase à large spectre ou une céphalosporinase plasmidique (5 ; 6). Cela est probablement dû au fait que dans la plupart des souches qnr positives, le gène qnr se trouve compris dans des intégrons localisés sur des plasmides conjugatifs, portant d’autres gènes de résistance, y compris les gènes de BLSE (7). Dans notre étude, deux types de BLSE ont été identifiés parmi les souches qnr positives.
Trois souches d’Enterobacter cloacae qnrB4 produisent une ß-lactamase à spectre élargi de type SHV-12. Cette association qnrB4 et SHV-12 a été rapportée parmi les souches de Klebsiella pneumoniae, isolées à Séoul (8). Par contre, ce variant est associé au CTX-M-28 chez deux souches de Klebsiella pneumoniae. Les autres variants (A1, B1, B2 et S1) sont associés à CTX-M-28.

Conclusion

Les gènes qnr sont largement diffusés dans les souches isolées à l’hôpital Ibn Rochd, Casablanca, Maroc. Les gènes qnr sont associés essentiellement avec des BLSE de type Shv-12 ou CTX-M-28. L’analyse des CMI pour les fluoroquinolones montre qu’il existe probablement d’autres mécanismes de résistance plasmidique aux quinolones. La présence du gène qnr dans des souches sensibles aux quinolones ne peut être suspectée à l’aide de l’antibiogramme standard et pourrait faciliter la sélection in vivo des mutants résistants en présence d’antibiotique.

Références Bibliographiques
1- Martínez-Martínez L., A. Pascual, and G. A. Jacoby. 1998. Quinolone resistance from a transferable plasmid. Lancet 351:797-799.
2- Robicsek, A., J. Strahilevitz, G. A. Jacoby, M. Macielag, D. Abbanat, K. Bush, and D. C. Hooper. 2006. Fluoroquinolone modifying enzyme: a novel adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nature Med. 12:83-88.
3- Périchon, B., P. Courvalin, and M. Galimand. 2007. Transferable resistance to aminoglycosides by methylation of G1405 in 16S rRNA and to hydrophilic fluoroquinolones by QepA-mediated efflux in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 51: 2464-2469.
4- Robicsek, A., J. Strahilevitz, D. F. Sahm, G. A. Jacoby, and D. C. Hooper. 2006. qnr Prevalence in Ceftazidime-Resistant Enterobacteriaceae Isolates from the United States. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 2872-2874.
5- Poirel, L., M. Van De Loo, H. Mammeri , and P. Nordmann. Association of plasmid-mediated quinolone resistance with extended-spectrum betalactamase VEB-1. 2005. Antimicrob Agents Chemother. 49:3091–3094.
6- Jacoby, G.A., N. Chow, and K.B. Waites. Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance. 2003. Antimicrob Agents Chemother.47:559–562
7- Wang, M., D. F. Sahm, G. A. Jacoby, and D. C. Hooper. 2004. Emerging plasmid-mediated quinolone resistance associated with the qnr gene in Klebsiella pneumoniae clinical isolates in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 48:1295–1299.
8- Pai, H., M.R. Seo, and T.Y. Choi. 2007. Association of QnrB Determinants and Production of Extended-Spectrum b-Lactamases or Plasmid-Mediated AmpC b-Lactamases in Clinical Isolates of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 51:366–368.

   

 

 
     

 


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